蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法

   到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。近年來(lái)還出現(xiàn)了一種新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射線的方法產(chǎn)生的更早，也更加的成熟，解析的數(shù)量也更多，我們知道，*個(gè)解析的蛋白的結(jié)構(gòu)，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發(fā)展起來(lái)的。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

   這兩種方法的一般的步驟和各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。電子顯微鏡（electron microscopy）作為一種新型的技術(shù)，目前的應(yīng)用還是非常少，并且比較狹窄，我可能等到zui后在給它作些介紹，而且相信絕大多數(shù)人也沒有聽說(shuō)過，也不會(huì)有很大的興趣。

1.首先是X晶體衍射。首先要得到蛋白質(zhì)的晶體。
   通常，都是將表達(dá)蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達(dá)載體中，然后在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，提純之后摸索結(jié)晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80％，將晶體進(jìn)行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過一系列的計(jì)算，很快就能得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。
用x射線的優(yōu)點(diǎn)是：速度快，通常只要拿到晶體，甚至當(dāng)天就能得到結(jié)構(gòu)，另外不受大小限制，無(wú)論是多大的蛋白，或者復(fù)合體，無(wú)論是蛋白質(zhì)還是RNA、DNA，還是結(jié)合了什么小分子，只要能夠結(jié)晶就能夠得到其原子結(jié)構(gòu)。所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結(jié)晶的條件。這個(gè)時(shí)候運(yùn)氣就顯的特別重要。關(guān)于這個(gè)有好多有趣的離子。據(jù)說(shuō)國(guó)外一個(gè)同學(xué)在摸索兩個(gè)月無(wú)果之后，毅然去度假，就將蛋白扔在一個(gè)很隨便的地方，等度假回來(lái)之后，卻發(fā)現(xiàn)已經(jīng)結(jié)晶了。

2.NMR（nuclear magnetic resonance）現(xiàn)象早已發(fā)現(xiàn)了很久，然后將這種方法用來(lái)解析蛋白結(jié)構(gòu)，卻是近一二十年的事情。不過到今天為止，用nmr方法來(lái)解析結(jié)構(gòu)已經(jīng)十非常成熟的方法。
原理暫且放在一邊，先說(shuō)常規(guī)步驟。
首先通過基因工程的方法，表達(dá)出目的蛋白，提純之后，摸索一下蛋白穩(wěn)定的條件，如果蛋白沒有聚合，而且折疊良好，便將蛋白樣品（通常是1mM－3mM，500ul，Ph6－7的PBS）裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后用一系列寫好的程序控制譜儀，發(fā)出一系列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N13、C13原子，等電磁波發(fā)射完畢，在收集受激發(fā)的原子所放出的“能量”，其實(shí)也是小磁場(chǎng)，通過收集數(shù)據(jù)、譜圖處理、電腦計(jì)算從而得到蛋白的原子結(jié)構(gòu)。
它的優(yōu)點(diǎn)就是，蛋白在液體中得到結(jié)構(gòu)，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，事實(shí)上所有在pdb中或者文獻(xiàn)中發(fā)表的NMR結(jié)構(gòu)都是十個(gè)或者二十個(gè)結(jié)構(gòu)的ensemble（集合），這就是因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)都是進(jìn)行能量?jī)?yōu)化后符合條件的結(jié)構(gòu)，或者說(shuō)就是溶液中的蛋白結(jié)構(gòu)。因?yàn)槭莿?dòng)態(tài)就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。缺點(diǎn)是，受大小的限制，到目前為止NMR解析蛋白結(jié)構(gòu)的上限是50kd。

   無(wú)論是晶體還是NMR，蛋白都要符合下面的條件：首先表達(dá)量要大，象NMR要求1個(gè)mM500UL，這就要求十幾個(gè)毫克，結(jié)晶要摸索很多的條件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞質(zhì)中表達(dá)才行。其次，蛋白要折疊。我們知道許多蛋白，尤其是真核蛋白在大腸桿菌中是以包含體的形式存在，這種情況下是不行的，除非復(fù)性。如果你的蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)，如果你不確定是不是表達(dá)，可以從分子篩上的位置，或者掃CD確定一下，當(dāng)然zui簡(jiǎn)單的是做一個(gè)NMR一維譜，只需要幾分鐘。
小于20Kd的蛋白可以考慮NMR，因?yàn)镹MR研究功能核相互作用方面是更加擅長(zhǎng)的，而且不需要結(jié)晶，現(xiàn)在速度也不慢。如果比較大，可以考慮晶體解析。

   對(duì)于用NMR來(lái)解析結(jié)構(gòu)，zui重要的條件就是非常昂貴的核磁譜儀，以及同位素標(biāo)記蛋白。只要采集了譜之后就算的得到了原始數(shù)據(jù)，其他的在電腦上通過專業(yè)的軟件處理就可以了。對(duì)于小分子蛋白不需要同位素標(biāo)記，也不需要600、800MHz的譜儀，一般的400、500MHz的小型譜儀也可以做了，但是對(duì)于10K以上的蛋白，基本上就要用磁場(chǎng)更強(qiáng)的600、800Mhz的核磁譜儀。