ELISA測定技術的發(fā)展

Elisa試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。然而，影響Elisa試驗結果的因素很多，故加強各個環(huán)節(jié)的質量保證才能充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點。
一、Elisa試劑盒測定技術的發(fā)展
臨床測定技術的發(fā)展主要在于方法學的發(fā)展，而方法學的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術不斷進步更新和型標記物的應用。目前，分子生物學正在并zui終肯定會讓我們對整個生命科學有一個全面而*的認識，其對免疫測定技術發(fā)展的影響也是直接而又有效的，它使我們對以前一些難以檢測的生物活性物質的測定變得輕而易舉，并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。
1、基因工程試劑對免疫測定技術 發(fā)展的影響
免疫測定技術的基礎在于抗原抗體之間的特異結合反應，所以任何的診斷試劑離不開的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標記物如酶標結合物則通過各總化學合成方法制備。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結合物等免疫測定試劑幾成為現(xiàn)實的新一代試劑，各種新型使用的測定方法也不斷出現(xiàn)。
HBsAg試劑特點（檢測模式：臨 床抗體夾心法）：
包被抗體為山羊多抗，多抗具有高親和性和對抗原各種表位的反應性。
酶表抗體為與HBsAg有不同結合位點的鼠復合單位。
可測得HBsAg變異樣品。
提高檢測的特異性（99.98%）
提高檢測的靈敏度，應用Parl  Ehrich 學說（PEI）HBsAg標準品，對ad標準品的靈敏度為0.05nｇ/ml對ay標準品靈敏度為0.025ng/ml

2、基因工程
較早用于免疫測定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,這兩種基因工程抗原的出現(xiàn)，較好地解決了抗HBc和HBe的測定問題。因為要從病毒本身去大量獲取這兩種純抗原較為困難，并且這一點對于難培養(yǎng)的病原微生物來說，如HIV、HCV和梅毒螺旋體等都有些共性。
2.1 HCV-Elisa試劑
HCV目前尚不能體外培養(yǎng)，只能用基因工程或化學合成方法獲取HCV結構和非結構區(qū)的各種抗原片斷，已知HCV基因組有7個功能區(qū)組成：核心、E₁、E₂/NS₁ NS₂ NS₃ NS₄ NS₅（有分為NS和NS_5b）區(qū)，合成抗原的優(yōu)點是易于純化，特異性好，抗原抗體反應強。
2.1.1*代抗HCV-Elisa試劑盒：
-由美國ortho公司克隆C₁₀₀₃抗原幾個片斷與人超氧化物歧化酶（SOD）結合。用酵母從病毒基因組非結合區(qū)得到表達，表達為融合蛋白，亦作為包被固相載體。
-抗原組合：NS₄ 區(qū)二個基因片斷為NS _5-1-1和C₁₀₀₃
-特性：IgG抗C₁₀₀在發(fā)病后數(shù)月后，才檢出，故不宜作早期診斷。
-約由20%的病人不出現(xiàn)抗體。IgM抗-C₁₀₀急性期檢出率只有64%。
-C₁₀₀的抗原性較弱，在HCV復制中，不能充分暴露宿主的免疫系統(tǒng)。
-特異性和靈敏性較差。
2.1.2第二代HCV-ELISA試劑盒
-用基因重組的HCV結構蛋白與非結構蛋白抗原包被固相載體。
-抗原組合：核心區(qū)（C區(qū)）多肽C₂₂  NS區(qū)多肽C₃₃  C₁₀₀₃和NS _5-1-1
-增加C₂₂區(qū)和C₃₃區(qū)后，抗體出現(xiàn)早，有助早期診斷，提高陽性率。有利早期診斷。
-C₂₂是早期易出現(xiàn)病毒血癥
2.1.3第三代HCV-ELISA試劑盒
人工合成多肽抗原，由36個氨基酸組成的Cp9（內(nèi)殼蛋白）和19個氨基酸組成Cp10混合包被固相載體。
抗原組合：除有C _100-3  C₂₂  C₃₃ 外又增加了core 和NS₃   NS₄  NS₅
特點：
      *core  NS3 NS5由Baculovirus 重組表達，沒有非特異性的   載體，試劑特異性高 ，重組的蛋白經(jīng)融合形成大分子抗原，利于提高檢測靈敏度。
      * NS₃ 區(qū)增加了氨基酸片斷（比例十分重要）。改進了反映的靈敏度。
      * NS₅ 經(jīng)優(yōu)化，徐去了非特異性的區(qū)域（G-D-D）NS₃  NS₅是血轉化zui早測得的抗體，提高了診斷的準確性。
      * NS₄ 為倆個片斷的合成多肽，去掉了非特異性反應的區(qū)域，加強了試劑的靈敏度和特異性。
2.1.4第四代HCV—ELISA 試劑盒
-美國新近推出一種包括HCV基因組7個功能區(qū)所有免疫決定基的單一融合蛋白，稱為多決定基融合抗原，采用表面活性劑處理分界病毒表面復合物，釋放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，靈敏度可達500拷貝/ml，已接近核酸擴增檢測水平。
-抗原組合：以Core和NS₃作為主要檢測片斷（比例十分重要）加合成多肽NS₄
-特點：直接測Core抗原
             不易發(fā)生變異
             抗IgM 和IgG檢出率可達100%
             特異性達99.8%靈敏度為100%