豬胰腺干細胞分離鑒定

糖尿病是性醫(yī)學難題,目前,對糖尿病的治療雖然有很多方法,但都不能從根本上解決問題。主要受制于供體不足和免疫排斥的問題。因此,人們寄希望于干細胞替代療法。干細胞增殖力強、數(shù)量充足、移植排斥反應(yīng)相對較低,更重要的是胰腺干細胞可塑性強,可以分化形成胰腺組織的各種細胞。豬胰腺干細胞的研究,目的在于解決干細胞來源的問題. 本人在實驗室以往的工作基礎(chǔ)上,進一步分離、鑒定豬胰腺干細胞。無菌采集胎豬胰腺120例,采用酶消化法,用RPMI1640加入1mmol/L丙酮酸鈉,71.5μmol/Lβ-巰基乙醇,20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF,100U/mL青霉素100U/mL、鏈霉素0.1mg/mL,添加10% FBS作培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。結(jié)果有59例僅獲得原代細胞,部分傳至6～8代后,細胞大量飄浮死亡。同時觀察到細胞傳至6～8代時,隨著細胞的大量死亡漂浮,皿底始終零散地保留一些圓形的、折光性強的小細胞。此時采用含20%血清的上述培養(yǎng)液后,皿中的小細胞在換液24h后形態(tài)發(fā)生變化,變大、變長,迅速擴增。48h后,每個小圓細胞形成一個克隆,96h后形成大的克隆,直徑超過100um,隨后細胞不斷從集落邊緣遷徙出來,細胞間相互連接,形成網(wǎng)絡(luò)狀生長,5～6天就會融匯成單層,此類細胞可以多次進行傳代。由此發(fā)現(xiàn)胰腺干細胞不能傳過7～8代的制約因素,成功地突破了胰腺干細胞擴增難題,并且一次獲得4株胰腺干細胞,其中一株已經(jīng)順利傳至64代,另3例傳至10代,各代均有凍存;在誘導(dǎo)分化實驗中觀察到如果用無血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)胰腺干細胞向β細胞分化,細胞可以大量形成胰島細胞團,但是成團后細胞活力很快下降,發(fā)黑、漂浮甚至死亡。因此,進一步探索了誘導(dǎo)條件,采用含血清的誘導(dǎo)液誘導(dǎo),不僅可以促使胰腺干細胞向胰島內(nèi)分泌細胞分化,而且有效地避免了細胞分化后活力下降的問題。利用高糖刺激胰島素釋放實驗,胰島素和c-肽的分泌量分別可以達到306.87±20.72 mIU/mL和0.31±0.11ng/mL。 經(jīng)免疫組化檢測,細胞表達目前*的胰腺干細胞特異性標記物,如胰腸同源域因子1、葡萄糖轉(zhuǎn)運子2、巢蛋白和波形蛋白,經(jīng)RT-PCR檢測,細胞表達胰腸同源域因子1、葡萄糖轉(zhuǎn)運子2、胰淀素前體、胰島素、生長抑素,確定分離獲得的細胞為胰腺干細胞。細胞經(jīng)成骨細胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后,有明顯的細胞聚集成團塊狀物的形成,經(jīng)茜素紅染色呈陽性;向神經(jīng)細胞誘導(dǎo)后,細胞NF-200染色陽性;細胞亦表達胚胎干細胞的一些標志,如強表達胚胎干細胞的表面標志物OCT-4、胚胎階段特異性抗原（1Stage-specific embryonic antigens SSEA-1）;用流式細胞儀證實細胞表達骨髓間充質(zhì)干細胞的一些表面標志,如CD29,CD44,CD166。通過裸鼠致瘤性實驗證實所分離的胰腺干細胞無致瘤性。并制備了大鼠糖尿病模型,將誘導(dǎo)后的細胞經(jīng)腹腔注射給大鼠模型用于治療,僅在注射后的2～4天內(nèi),血糖略有下降。